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旋渦混合器在染色體標(biāo)本的FISH技術(shù)的應(yīng)用

更新時(shí)間:2012-11-26   點(diǎn)擊次數(shù):4993次
 ?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)?zāi)康?br />  
  1.掌握FISH技術(shù)的一般原理,及其基本實(shí)驗(yàn)方法;
  
  2.了解FISH技術(shù)的發(fā)展概況,以及應(yīng)用范圍。
  
  (二)實(shí)驗(yàn)原理
  
  FISH是以分子雜交為基礎(chǔ),應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)標(biāo)記核酸探針,通過堿基互補(bǔ)的原理與靶DNA雜交,在核中或染色體上顯示靶DNA序列位置的方法。FISH技術(shù)可分為四個(gè)步驟:樣品制備、探針標(biāo)記、雜交及其檢測(cè)。
  
 ?。ㄈ?shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
  
  1.材料染色體標(biāo)本或血涂片
  
  2.試劑甲醇、乙醇、乙酸、標(biāo)記探針(生物素標(biāo)記探針或地高辛標(biāo)記探針)、3mol/L乙酸鈉、甲酰胺(分子生物學(xué)級(jí)和粗制品)、雜交緩沖液(4×SSC,20%硫酸葡萄糖)、鮭精DNA、磷酸鈉、Tween20、BSA、檢測(cè)液(5μg/ml熒光素偶聯(lián)的親和素或6μg/ml羅丹明偶聯(lián)的抗地高辛抗體)DAPI
  
  3.儀器低溫高速離心機(jī)、熒光顯微鏡、MixPlus旋渦混合器、移液器、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、烤箱
  
 ?。ㄋ模?shí)驗(yàn)方法與步驟
  
  1.探針混合與變性
  
  (1)混合20~60ng標(biāo)記探針DNA和3~5μg鮭精DNA。反應(yīng)后體積少于10μl,可直接凍干;若體積較大,可加1/20體積的3mol/L乙酸鈉和2倍體積100%乙醇沉淀DNA?;靹虿⒂?70℃30min。在4℃,12000r/min離心10min,棄上清,沉淀物以300μl70%乙醇洗滌后在離心(同上),棄上清,凍干。
  
 ?。?)將DNA重懸于5μl去離子的甲酰胺中,室溫旋渦混勻3min。
  
 ?。?)加入5μl雜交緩沖液,,MixPlus旋渦混合器中混勻5min。
  
 ?。?)將DNA探針置于75℃水浴中變性5min。迅速置于冰浴中5min,備用。
  
  2.樣本處理
  
 ?。?)染色體制備標(biāo)本或血涂片在室溫下依次用70%、90%、100%的乙醇脫水,各5min。涼干備用。
  
  (2)變性前將載玻片置60℃烤箱內(nèi)孵育,目的是防止變性液加至載玻片時(shí)溫度降低。
  
  (3)將變性液在水浴箱中加熱至70℃。
  
 ?。?)將預(yù)熱的載玻片移至含變性液(70%去離子甲酰胺、2×SSC和50mmol/L磷酸鈉)的Coplin廣口瓶內(nèi)2min。
  
 ?。?)立即將載玻片依次移入70%、90%和100%預(yù)冷的乙醇中,各5min。防止DNA復(fù)性。
  
 ?。?)空氣干燥。
  
  3.雜交
  
 ?。?)將10μl含變性探針的雜交混合液加至載玻片上變性的靶DNA上。
  
  (2)在雜交液上蓋上蓋玻片,防止產(chǎn)生氣泡。
  
 ?。?)用橡膠泥將蓋玻片四周封好,并置濕盒內(nèi)37℃溫浴過夜。
  
  4.檢測(cè)
  
  (1)從濕盒內(nèi)取出載玻片,除去橡膠泥。
  
  (2)將載玻片置于42℃預(yù)溫的漂洗液A(50%甲酰胺,2×SSC)中,在恒溫水浴搖床中振蕩10min,并使蓋玻片脫落。更換漂洗液A兩次,每次振蕩5min。
  
 ?。?)將載玻片移入60℃預(yù)溫的漂洗液B(1×SSC~0.1×SSC,pH7.0,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整。),漂洗5min,更換漂洗液B兩次,每次5min。
  
  (4)將載玻片取出,甩盡液體,加200μl封閉液(3%BSA,4×SSC,0.1%Tween20),蓋上蓋玻片,防止氣泡產(chǎn)生,置于濕盒內(nèi),37℃溫浴30min以上。
  
 ?。?)移去蓋玻片,除去多余液體,加200μl檢測(cè)液(5μg/ml熒光素偶聯(lián)的親和素或6μg/ml羅丹明偶聯(lián)的抗地高辛抗體,緩沖液為1%BSA、4×SSC和0.1Tween20),在37℃濕盒內(nèi)溫浴30min。
  
 ?。?)移去蓋玻片,將載玻片置于漂洗液C(4×SSC,0.1%Tween20,pH7.0)中,42℃振蕩漂洗3次,各5min。
  
  (7)將載玻片置于復(fù)染液(2×SSC,200ng/mlDAPI)中,室溫振蕩20min。
  
  (8)載玻片在漂洗液D(2×SSC,0.05%Tween20)中室溫溫育1min~2min。
  
  (9)熒光顯微鏡下觀察。

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